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I 已知SARS是由一種RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康復后的血清中有抗S蛋白的特異性抗體。某研究小組為了研制預防SARS病毒的疫苗，開展了前期研究工作。其簡要的操作流程如下：

（1）實驗步驟①所代表的反應過程是             。

（2）步驟②構建重組表達運載體A和重組表達運載體B必須使用限制性內切酶和

          酶，后者的作用是將用限制性內切酶切割的            和          連接起來。

（3）如果省略步驟②而將大量擴增的S基因直接導入大腸桿菌，一般情況下，不能得到表達的S蛋白，其原因是S基因在大腸桿菌中不能              ，也不能            。

（4）為了檢驗步驟④所表達的S蛋白是否與病毒S蛋白有相同的免疫反應特性，可用

                與                  進行抗原―抗體特異性反應實驗，從而得出結論。

II． 1958年，Meselson和Stahl通過一系列實驗首次證明了DNA的半保留復制，此后科學家便開始了有關DNA復制起點數(shù)目、方向等方面的研究。試回答下列問題：

（1）由于DNA分子呈___________結構，DNA復制開始時首先必需解旋從而在復制起點位置形成復制叉（如圖1）。因此，研究中可以根據復制叉的數(shù)量推測___________________。

（2）1963年Cairns將不含放射性的大腸桿菌（擬核DNA呈環(huán)狀）放在含有³H-胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進一步證明了DNA的半保留復制。根據右邊的大腸桿菌親代環(huán)狀DNA示意圖，在答題紙的相應方框內用簡圖表示復制一次和復制兩次后形成的DNA分子。（注：以“……”表示含放射性的脫氧核苷酸鏈）。

（3）DNA的復制從一點開始以后是單向還是雙向進行的，用不含放射性的大腸桿菌DNA放在含有³H-胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，給以適當?shù)臈l件，讓其進行復制，得到圖3所示結果，這一結果說明________________。

（4）為了研究大腸桿菌DNA復制是單起點復制還是多起點復制，用第（2）題的方法，觀察到的大腸桿菌DNA復制過程如圖4所示，這一結果說明大腸桿菌細胞中DNA復制是            起點復制的。

7．將動物致病菌的抗原基因導入馬鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關的圖和表。

表1   引物對序列表

表2  幾種限制酶識別序列及切割位點數(shù)

請根據以上圖表回答下列問題。

（1）在采用常規(guī)PCR方法擴增目的基因的過程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體內的DNA聚合酶，其最主要的特點是__________。

（2）PCR過程中退火（復性）溫度必須根據引物的堿基數(shù)量和種類來設定。表1根據模板設計的兩對引物序列，圖2為引物對與模板結合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？________________________________________。

（3）圖1步驟3所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列是否有專一性要求？                            

（4）PCR反應中由堿基錯配引起的變異來源于__________。假設對一個DNA進行擴增，第一次循環(huán)時某一模板鏈上發(fā)生堿基錯配，則擴增若干次后檢測所有DNA的擴增片段與原DNA相應片段相同的是__________。

（5）對符合設計要求的重組質粒T進行酶切，假設所用的酶均可將識別位點完全切開，請根據圖1中標示的酶切位點和表2所列的識別序列，對以下酶切結果作出判斷。

①采用EcoRI和PstI酶切，得到__________種DNA片段。

②采用EcoRI和SmaI酶切，得到__________種DNA片段。

mtDNA是存在于人類細胞線粒體中雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子，具有自我復制、轉錄和控制合成蛋白質的功能。mtDNA的類型具有明顯的種族特異性。若用兩種識別切割序列完全不同的限制酶M和N切割某人的mtDNA，通過凝膠電泳分離分析得下表。限制酶M和N的識別序列和切割位點如圖所示。

⑴．該mtDNA的長度為___________kb。在該DNA分子中，M酶與N酶的切割位點分別有____________個。

⑵．M酶與N酶切出的能相互粘連的末端能在______________酶的作用下相互連接，請將連接的結果表示出來：_______________________。連接后的序列是否可以用M酶、N酶進行切割，并簡述理由：_________________________________________________

⑶．有人認為mtDNA能成為研究人類起源與進化的一個有力工具，請簡述理由：_________________________________________________________________________ 。

下圖為真核細胞的某基因的結構圖以及限制酶M和N的切割位點。

⑷．現(xiàn)用該基因作為目的基因，若采用直接從供體細胞中分離，具體方法是：_____________。這個方法雖操作方便，但切割下的基因中含有不能指導蛋白質合成的區(qū)域。因此，目前往往采用逆轉錄的人工合成的方法，其基本步驟是：__________________________。

⑸．已知Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個，空白區(qū)域中G和C的總數(shù)共有400個，則由該區(qū)轉錄的mRNA中A和U總數(shù)是               。

（10分）mtDNA是存在于人類細胞線粒體中雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子，具有自我復制、轉錄和控制合成蛋白質的功能。mtDNA的類型具有明顯的種族特異性�，F(xiàn)用兩種限制性核酸內切酶M和N切割某人的mtDNA（限制酶M和N的識別序列和切割位點如圖1所示），然后通過凝膠電泳分離DNA片段（通電狀態(tài)下，不同分子量的DNA片段在瓊脂中的移動距離不同從而被分離），分析后得到下表。

（1）該mtDNA的長度為___________kb。在該DNA分子中，M酶與N酶的切割位點分別有____________個。

（2）M酶與N酶切出的能相互粘連的末端能在______________酶的作用下相互連接，請將連接的結果表示出來：_______________________。連接后的序列是否可以用M酶、N酶進行切割，請簡述理由：________________________________________。

（3）圖2為真核細胞的某基因的結構圖以及限制酶M和N的切割位點�，F(xiàn)用酶切法直接從供體細胞中切割圖2中的基因從而獲得目的基因，可選用酶______來切割。這個方法雖然操作方便，但切割下的基因中含有不能指導蛋白質合成的區(qū)域。因此，目前往往采用逆轉錄的人工合成的方法，其基本步驟是：__________________。

圖2

（4）已知圖2中Ⅱ區(qū)的堿基數(shù)是2000個，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個，空白區(qū)域中G 和C的總數(shù)共有400個，則由該區(qū)轉錄的mRNA中A和U總數(shù)是_____________。

綠色熒光蛋白GFP能在藍光或紫外光的激發(fā)下發(fā)出熒光，這樣借助GFP發(fā)出的熒光就可以跟蹤蛋白質在細胞內部的移動情況，幫助推斷蛋白質的功能。下圖為我國首例綠色熒光蛋白（GFP）轉基因克隆豬的培育過程示意圖，據圖回答：

（1）若限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G^↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是—^↓GATC—，在質粒上有酶Ⅰ的一個切點，在目的基因的兩側各有1個酶Ⅱ的切點，在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來__________，理由是： ___________________________________________。

（2）過程③將重組質粒導入豬胎兒成纖維細胞時，采用最多的方法是______________________。

（3）獲得轉基因豬的關鍵步驟是_____（填序號），GFP基因的作用是作為_______。抑制小豬抗原表達的基因要插入到啟動子和_________之間。獲得的轉基因克隆豬，可以解決的醫(yī)學難題是可以避免     _____________________。

（4）目前科學家們通過蛋白質工程制造出了藍色熒光蛋白，黃色熒光蛋白等，采用蛋白質工程技術制造出藍色熒光蛋白過程的正確順序是：_____________________（用數(shù)字表示）。

①推測藍色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸

②藍色熒光蛋白的功能分析和結構設計序列

③藍色熒光蛋白基因的修飾（合成）  

④表達出藍色熒光蛋白。